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酵素の生化学的な正体は、1900年代初頭にはまだ不明であった。多くの科学者は酵素活性がタンパク質と関連していることを観察していたが、他の科学者（ノーベル賞受賞者のリチャード・ウィルシュテッターなど）は、タンパク質は真の酵素の単なるキャリアであり、タンパク質それ自体は触媒作用ができないと主張していた。1926年、ジェームズ・B・サムナーはウレアーゼという酵素が純粋なタンパク質であることを示し、それを結晶化させた。1937年にはカタラーゼという酵素も同様に結晶化させた。純粋なタンパク質が酵素になりうるという結論は、消化酵素ペプシン（1930年）、トリプシン、キモトリプシンの研究を行ったジョン・ハワード・ノースロップとウェンデル・メレディス・スタンリーによって決定的に示された。これら3人の科学者は1946年にノーベル化学賞を受賞した。