短いタンパク質はペプチド合成と呼ばれる一連の方法によって化学的に合成することもできる。これは化学ライゲーションなどの有機合成技術に依存して高収率でペプチドを生産する。化学合成では、アミノ酸側鎖に蛍光プローブを結合させるなど、ポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を導入することができる。これらの方法は実験室での生化学や細胞生物学に有用であるが、しかし、一般的には商業用には使われない。化学合成は約300アミノ酸より長いポリペプチドでは効率が悪く、合成されたタンパク質は本来の三次構造をなかなかとらない。ほとんどの化学合成法は、生物学的反応とは逆に、C末端からN末端へと進む。