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ULを超える量の葉酸の長期摂取を求めた臨床試験のレビューでは、懸念が提起されている。サプリメント由来の過剰摂取は、天然食品由来の摂取よりも懸念され、ビタミンB₁₂との相対的な割合が、有害作用の重要な要因となる可能性がある。一説によると、葉酸を生物学的に活性な形に変換する酵素ジヒドロ葉酸還元酵素の速度が制限されるため、大量の葉酸を摂取すると、血中に未代謝の葉酸が検出可能な量だけ循環するようになるという。血中の葉酸が健康に悪影響を及ぼすという証拠は一貫しておらず、葉酸には、遊離葉酸が疾患発症に関与する可能性を高めるような補因子機能は知られていない。しかし、ビタミンB₁₂の低値と葉酸の高摂取の組み合わせは、先に述べた神経障害のリスクに加えて、高齢者の認知機能障害のリスクを増加させるようである。1,000 μg/日を超える葉酸サプリメントの長期使用は、前立腺がんリスクの上昇に関連している。